Como o Simoa conta moléculas de proteína individualmente
Um imunoensaio em sanduíche, como o ELISA, com leitura em micropoços de femtolitros. Em baixa ocupação, a maior parte das microesferas carrega zero ou um complexo marcado. O confinamento do produto enzimático permite contar poços positivos e detectar concentrações muito baixas. O limite de detecção depende do analito, do fundo e da validação do ensaio.
Mesma enzima, um bilhão de vezes menos volume
Do plasma à imagem de fluorescência
Percorra o ensaio passo a passo. As quatro primeiras etapas ocorrem em suspensão, sobre microesferas paramagnéticas (cerca de 2,7 µm, aproximadamente 500.000 por teste); as duas últimas ocorrem no disco de arranjos.
Contagem de poços e por que Poisson importa
Como, em baixa concentração, há muito mais microesferas do que moléculas-alvo, cada microesfera carrega zero ou uma enzima na maior parte das vezes. O número de enzimas por microesfera segue uma distribuição de Poisson com média λ. O equipamento mede a fração de poços com microesfera que estão fluorescentes, fon, e a converte em média de enzimas por microesfera (AEB, average enzymes per bead).
analógico: AEB = fon × Īon / Īúnica (usado em carga maior, quando a contagem satura)
Mova o controle de concentração e observe o arranjo, o histograma de ocupação e a posição na curva de calibração. Um pequeno sinal de fundo inespecífico está incluído; ele define o piso que determina o limite de detecção.
Enzimas por microesfera (Poisson, fração das microesferas)
Premissas do modelo, escolhidas numa faixa realista: 100 µL de amostra efetiva, 500.000 microesferas, 50% de eficiência de captura e cerca de 60% dos poços recebendo microesfera. Ensaios reais variam conforme analito, par de anticorpos e diluição; o eixo é ilustrativo, não uma especificação.
Reduza o volume, mantenha a enzima
Uma molécula de estreptavidina-β-galactosidase convertendo substrato por 30 segundos gera da ordem de 104 moléculas de resorufina (assumindo ~300 ciclos catalíticos por segundo). O que isso representa em concentração depende apenas do volume em que o produto fica retido.
O que considerar ao interpretar dados de Simoa
A calibração é por analito
O AEB é convertido em concentração por uma curva de calibradores (em geral, ajuste 4PL). Trocas de lote de microesferas, anticorpo detector ou calibrador podem deslocar valores absolutos; por isso, bridging e controles internos são essenciais em coortes longitudinais.
A matriz continua importando
A contagem de moléculas únicas resolve o problema do volume, não o da biologia. Anticorpos heterofílicos, hemólise, histórico de congelamento e descongelamento e diluição da amostra atuam antes de a microesfera chegar ao poço.
Duas ou três etapas
Alguns kits adicionam anticorpos de captura e detecção junto com a amostra; outros separam as etapas. O formato influencia o risco de efeito gancho (hook), o tempo de incubação e a sensibilidade, e é definido no protocolo de cada kit.